Po zbadaniu prawego dopływu Rzeki Św. Wawrzyńca, Richelieu, wyruszył w górę lewego dopływu rzeki Ottawy, stanowiącej najkrótszą drogę do Wielkich Jezior. Nadal był jeszcze przekonany, że będzie mógł tędy dotrzeć do Chin. W 1615 r. wybrał się Champlain w swoją ostatnią i największą podróż odkrywczą na terenie Kanady. Odkrył jeziora Nipis-sing, Simcoe, Huron, dotarł do jeziora Ontario. W walce z Irokezami nawiązał sojusz z Huronami, tradycyjnymi odtąd sojusznikami Francuzów. Przekonawszy się ostatecznie o niemożliwości znalezienia w tej części Ameryki drogi na Ocean Spokojny, Champlain podjął badania kraju Huronów, śmiertelnego wroga Ligi Pięciu Narodów. Ufni w pomoc francuską podjęli Huroni wyprawę odwetową przeciwko swoim wrogom. Broń palna towarzyszy Champlaina niewiele Huronom tym razem pomogła. Irokezi, a ściślej Senekowie odparli atak zza świetnie ufortyfikowanych palisad swojej twierdzy, sam Champlain został ranny i wyprawa przeciwko Irokezom skończyła się niepowodzeniem. Ekspedycja ta z 1616 r. nie przyniosła wprawdzie Francuzom sukcesów, dała jednak Champlainowi doskonałą znajomość kraju, którego został gubernatorem. Zalążek Nowej Francji (nazwa ta została wówczas już oficjalnie wprowadzona) stanowiło założone przez Champlaina w 1608 r. miasto Quebec.
